I microscopi elettronici a trasmissione (TEM) producono immagini ad altissima risoluzione per l’analisi dei campioni. La sfida è catturare queste immagini su pellicola senza dover rinunciare a questo livello di dettaglio. I medesimi elementi che rendono possibile questo dettaglio, gli elettroni, accrescono le difficoltà inerenti alla micrografia elettronica.

Utilizzando gli elettroni in modo efficace, tuttavia, è possibile ottimizzare la qualità dell’immagine massimizzando la densità, migliorando il contrasto e riducendo il rumore.

Il segreto è usare più elettroni: in altre parole, aumentare la frequenza di campionamento.

• Aumentare il tempo di esposizione
• Ridurre l’ingrandimento
• Regolare esposizione e sviluppo
• Cause del rumore della micrografia elettronica

Aumentare il tempo di esposizione

Il modo più semplice per utilizzare più elettroni per migliorare la qualità dell’immagine è aumentare il tempo di esposizione, come illustrato nella Figura 2. Gli ovvi vantaggi di questo sono l’aumento della densità e del contrasto. Inoltre, migliora anche il rapporto segnale-rumore: il segnale dell’immagine aumenta linearmente con l’esposizione (numero di elettroni assorbiti), mentre la struttura del rumore aumenta meno rapidamente con la radice quadrata dell’esposizione. Naturalmente, è anche possibile aumentare la densità e il contrasto aumentando l’attività di sviluppo (ad es. aumentando il tempo di sviluppo), tuttavia segnale e rumore aumentano proporzionalmente, determinando un rapporto segnale/rumore meno favorevole rispetto a quello ottenuto aumentando il tempo di esposizione.

Figura 2: se le condizioni del campione e dello strumento lo consentono, l’aumento dell’esposizione aumenterà la densità negativa, migliorerà il contrasto dell’immagine e il rapporto segnale-rumore.

Ridurre l’ingrandimento

Alcuni campioni non tollerano lunghi tempi di esposizione per via della loro instabilità o per altre considerazioni. In questi casi, una riduzione dell’ingrandimento dello strumento produrrà una migliore qualità dell’immagine. Se necessario, l’ingrandimento può essere ripristinato fotograficamente, con una lente di ingrandimento o tramite ingrandimento fotografico.

Figura 3: riducendo l’ingrandimento dello strumento e compensando con leggera perdita nei dettagli minimi (3C rispetto a 3A). I risultati sono paragonabili a una micrografia registrata con un ingrandimento totale inferiore (3B).

La riduzione dell’ingrandimento, pur consentendo a tutte le altre condizioni di rimanere invariate, consente a più elettroni di colpire un’unità di superficie di emulsione sulla pellicola senza modificare il numero di elettroni che attraversano il campione. Come illustrato nella Figura 3, la micrografia risultante è più densa e presenta un contrasto più elevato (3B rispetto a 3A). L’ingrandimento che viene sacrificato può essere ripristinato attraverso un ingrandimento ottico corrispondentemente maggiore (come illustrato nella figura 3C). Tuttavia, questo ripristino delle dimensioni dell’immagine può avvenire di pari passo a un aumento della granulosità della stampa per via del maggiore ingrandimento ottico.

La granulosità di stampa migliorata è evidente a un ingrandimento inferiore dove la frequenza di campionamento è stata aumentata (3B rispetto a 3A). Non vi sono più informazioni in 3C che in 3A, ma sono stati ottenuti maggiore densità e contrasto senza un aumento dell’esposizione, un fattore importante in situazioni che richiedono una limitazione dell’esposizione.

Regolare esposizione e sviluppo

La stabilità del campione determina in gran parte se la pellicola può raccogliere molti o relativamente pochi elettroni. La pellicola per immagine elettronica SO-163 funziona bene su una gamma di esposizioni di elettroni e risponde a condizioni di sviluppo compensative che produrranno micrografie di densità di stampa comparabile. Per via di questa versatilità, la pellicola per immagine elettronica SO-163 può essere utilizzata per accogliere campioni sia stabili sia instabili.

Figura 4: le caratteristiche di velocità e segnale-rumore della pellicola per immagine elettronica possono essere regolate in base alle condizioni di stabilità del campione selezionando le condizioni di esposizione compensatoria e sviluppo. Queste condizioni servono come punti di partenza.

Nella Figura 4, la corrente del fascio è più bassa (meno elettroni) in 4A, intermedia in 4B e massima (più elettroni) in 4C. Nel medesimo ordine, il tempo di sviluppo e l’attività del rivelatore sono stati ridotti per compensare il numero crescente di elettroni raccolti. In effetti, il contributo di densità per elettrone necessario per produrre una data densità viene modificato nell’elaborazione per adattarsi al numero di elettroni assorbiti. L’obiettivo qui, ancora una volta, è usare più elettroni. Raccogliere tanti elettroni quanti ne consentirà la stabilità del campione e regolare le condizioni di sviluppo per ottenere la densità e il contrasto desiderati.

Cause del rumore della micrografia elettronica

I processi utilizzati nella micrografia elettronica e nella fotografia ordinaria sono simili sotto molti aspetti. Entrambi implicano l’esposizione di un materiale fotografico, l’elaborazione di questo materiale in un’immagine negativa e la stampa del negativo su una copia positiva ingrandita. La differenza principale è l’esposizione agli elettroni di radiazione per la micrografia elettronica e alla luce per la fotografia convenzionale. Questa differenza è un fattore critico quando si lavora con TEM e tecniche fotografiche, in quanto gli elettroni interagiscono con le emulsioni fotografiche in un modo sostanzialmente diverso rispetto ai fotoni. Le fluttuazioni irregolari degli elettroni nel fascio sono normali. Queste fluttuazioni determinano un caratteristico aspetto granulare nel negativo fotografico elaborato. Questa struttura granulare (rumore) è più facilmente osservabile in aree di esposizione elettronica uniforme (Figura 5A) e non è dovuta alla grana fotografica intrinseca dell’emulsione (Figura 5B) o è necessariamente un’indicazione di instabilità dello strumento.

Inoltre, ciascun elettrone incidente è in grado di interagire con un numero di granuli di alogenuro d’argento lungo il suo percorso irregolare attraverso l’emulsione, rendendoli sviluppabili. Gli elettroni, quindi, contribuiscono in modo efficiente alla densità dell’immagine. In combinazione con le fluttuazioni caratteristiche del fascio, tuttavia, questa efficienza contribuisce alla struttura granulare che riconosciamo come rumore nell’immagine.

Quando la radiazione esponente è la luce, invece, un certo numero di fotoni deve interagire con ciascun granulo di alogenuro d’argento per renderlo sviluppabile. Ciò è dovuto principalmente al livello di energia dei fotoni (da 2 a 3 elettronvolt per la radiazione visibile), che è molte volte inferiore a quello degli elettroni in una tipica TEM (da 50.000 a 100.000 elettronvolt). Con l’esposizione ai fotoni, la trasmittanza di un campione viene campionata a una velocità di un ordine di grandezza maggiore rispetto all’esposizione agli elettroni. Di conseguenza, la granularità con esposizione ai fotoni viene ridotta al livello dell’emulsione stessa.